Anadolu Orkidesi Çiçeklerinden Proteaz Enziminin Saflaştırılması ve Endüstride Kullanımının Araştırı

Anadolu Orkidesi Çiçeklerinden Proteaz Enziminin Saflaştırılması ve Endüstride Kullanımının Araştırı


Prof. Dr. Nazan Demir / Kimya Bölümü - Fen Fakültesi - Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi

Anadolu Orkidesi (Orchis Anatolica) Çiçeklerinden Proteaz Enziminin Saflaştırılması ve Endüstride Kullanımının Araştırılması


Özet

Bu çalışmada bitkisel kaynaklı yeni bir proteaz enziminin aranmasına yönelik bir araştırma yapılmıştır. Bu amaçla zehirli olmadığı bilinen ve yumruları salep yapımında kullanılan Anadolu Orkidesi kullanılmıştır. Proteaz enzimi Anadolu Orkidesinden (Orchis anatolica) amonyum sülfat çöktürmesi,

iyon değişim ve afinite kromatografisi teknikleri kullanılarak saflaştırılmış ve karakterize edilmiştir (1). Bitkiden saflaştırılan proteaz enziminin kaç kat saflaştırıldığı hesaplanmıştır. Ayrıca enzimin optimum pH’sı ve sıcaklığı belirlenmiştir. Saflaştırma basamaklarında ve karakterizasyonu sırasında enzimin aktivitesini ölçmek için kazein substratı kullanılmıştır. Ayrıca enzimin substrat spesifikliği, kazein,

albumin, azoalbumin ve hemoglobin kullanılarak incelenmiştir. Enzim aktivitesi üzerine bazı kimyasalların etkisi incelenmiştir (2,3). Elde edilen sonuçlara göre Anadolu Orkidesi (Orchis anatolica) çiçeklerinin yüksek miktarda proteaz enzimi içermesi nedeniyle ilaç ve özellikle kozmetik sektöründe

çok önemli bir bitkisel kaynak olabileceği kanaatine varılmıştır.

 

Giriş

Hidrolazlar ana grubuna dâhil olan proteazlar (4.3.1.1), proteolitik enzimler olarak da bilinir. Bunlar peptit bağlarının su etkisiyle bölünmesini katalizlerler (4).

 

Bu enzimler genellikle, proteinaz, peptidaz ve amidaz olarak da adlandırılırlar. Proteinazlar proteinlerin iç peptit bağlarına etki ederek onları proteoz, pepton ve polipeptitlere bölerler. Bu grupta mide salgısının pepsini, pankreas suyunun tripsini, papaya bitkisinin lateksindeki papaini ve büyükbaş

hayvanların dördüncü midesindeki şirdenden özütleme ile elde edilen rennin vardır. Proteazlar hücre fizyolojisindeki kritik rolleri ve yeni bir yelpazeye yayılan endüstriyel kullanım potansiyelleri nedeniyle önemli bir enzim grubudur ve dünya enzim pazarında %60’lık bir pay ile ilk sırada bulunmaktadırlar (5). Bitkisel kaynaklı pek çok proteaz günümüze kadar lateks, meyve ve tohumlardan izole edilmiştir.

Bunların büyük bir kısmı sistein ailesine aittir (6). Bitkilerin tohumları ve meyveleri, yapraklarından çok daha fazla proteolitik enzim bulundurdukları için daha çok tohum ve meyveleri ile çalışılmıştır. Bitkilerin kök kısımlarında bulunan proteazlar ise mısır kökünden elde edilen serin proteaz hariç hemen hemen bilinmemektedir (7). Proteazlar bitkilerden, hayvanlardan ve mikrobiyal kaynaklardan elde edilebilirler.

Ancak günümüzde hayvanlardan insanlara geçen bazı hastalıkların basında yoğun bir şekilde yer almasından dolayı (SARS, deli dana, kuş gribi vs.), hayvansal proteazların özellikle gıda maddesi yapımında kullanımı konusunda kuşkular artmıştır ve bu gelişme araştırmacıları yeni bitkisel proteaz

kaynakları aramaya sevk etmiştir (1). Orkideler, Orchidacae familyasına ait olup; yaklaşık 450 cins ve 20.000 tür içermektedir (8). Anadolu, çok zengin bir bitki örtüsüne sahiptir (8). Türkiye, orta kuşak orkideleri bakımından Avrupa ve Ortadoğunun en zengin ülkelerinden biridir (9). Türkiye’de

Orchidaceae familyasına ait 24 cins ve 100 kadar tür saptanmıştır. Yumrulu orkideler ülkemizin birçok bölgesinde doğal olarak yetişmekte olup yumrularından gıda ve ilaç hammaddesi olarak kullanılan salep elde edilmektedir(10). Osmanlı orkidesi (ottoman orcho) ise Anadolu’da yetişen endemik

türlerden biridir. Anadolu orkidesi,(Orchidaceae) ise. 10-40 cm boyunda, yumrulu bitkilerdir. Dipte 2-4 şerit yaprak bulunur. Pembe renkli çiçekleri nisan-mayıs aylarında açar. Araştırmada kullanılacak Anadolu orkideside Çukurova yöresinde Toroslardan toplanarak kullanılmıştır(11).

 

Proteaz enzimi önemli fizyolojik rollere sahiptir. Başlıca dericilik, eczacılık, deterjan, gıda ve kozmetik endüstrilerinde kullanılmaktadır. Bu çalışmada amacımız ülkemizde yetişen anadolu orkidesi (orchis anatolica) çiçeklerinden kozmetik, ilaç ve gıda endüstrisinde kullanılabilecek proteaz enzimi saflaştırmak ve karekterizasyonunu yapmaktır.

 

Materyal ve Yöntem Bitki materyalı ve saklama koşulları

Mayıs-Haziran döneminde Anadolu orkidesi (Orchis anatolica) Mersin ili içinde bulunan Çamlıyayla’dan toplanmıştır. Proteaz enzimi saflaştırmak için toplanmış olan bitki kullanılana kadar -80oC’lik derin dondurucuda saklanmıştır.

 

Homojenatın hazırlanması

Dondurucuda muhafaza edilen 25 g bitki, ilk önce sıvı azot kullanılarak mekanik olarak parçalandı daha sonra 50 mL destile su içerisine alınarak ve manyetik karıştırıcı kullanılarak 30 dak. oda sıcaklığında karıştırıldı. Homojenat 30 dak. +4oC’de 5000xg’de santrifüjlendi. Böylece bitki posasının

protein çözeltisinden uzaklaştırılması sağlandı.

 

Coomasie blue yöntemi ile protein tayini

Bu yöntem, Coomassie brillant blue G–250 boyasının farklı konsantrasyonlardaki protein çözeltilerinde değişik şiddette mavi renk ortaya koymasından yararlanılarak geliştirilmiştir. Boyanın özellikle arginin gibi bazik amino asitlerle, tirozin ve triptofan gibi bazı aromatik amino asitlere bağlanma eğiliminde

olduğu gözlenmiştir. Coomassie brillant blue G–250 fosforik asitli ortamda proteinlere bağlanır ve oluşan kompleks 595 nm‘de maksimum absorbans gösterir. Yöntemin hassasiyeti 1-100 mg arasındadır (11).

 

Amonyum sülfat çöktürmesi

Homojenatta %10 ve %100’lük arasında 0–20, 20–40, 40– 60, 60–80 ve 80–100 olacak şekilde amonyum sülfat çöktürmesi yapıldı. Kullanılan Amonyum sülfatın gram miktarı aşağıdaki formülden hesaplandı.

 

CM- selüloz kolonu iyon değişim kolonunun hazırlanması

5 gram kuru CM-selüloz bir beher içerisinde 100 mL 0,5 M NaOH ile aktifleştirildi ve oda sıcaklığında 24 saat şişmeye bırakıldı. Kullanılan NaOH iyon değişim uçlarının dışarı çıkmasını sağladı. 0.5 M HCl ile yıkanarak ortam nötralize edildi. Jel asetat tamponu (0,01 M, pH: 5) içerisine alındı. Çapı 1,3 cm ve boyu 30 cm olan kromotografi kolonuna bir huni yardımı ile tampon dolduruldu. Bir gün önceden

şişirilen ve aktif grupları ortaya çıkarılmış CM-Selüloz peristaltik pompa yardımı ile kolona paketlendi ve kolon aynı tampon çözelti (0,01 M pH: 5 asetat tamponu) ile dengelendi. Kolonun dengelenmesi üstten alınan sıvı ile alttan alınan sıvının 280 nm’deki absorbanslarının aynı olması ile anlaşıldı.

 

Afinite kromotografisi

Afinite jeli sepharose-4B matriksi üzerinde hazırlandı. Sepharose-4B’nin CNBr ile aktifleştirilmesinden sonra, L-tirozin kovalent olarak takıldı. Daha sonra p-amino benzoik asit diazolanarak tirozine kenetlendi. Burada tirozin afinite jelinin uzantı kolunu oluştururken p-amino benzoik asit ise enzime spesifik olarak bağlanacak kısmı oluşturmaktadır.

 

Proteaz enzim aktivitesinin tespiti

Proteolitik aktivite kazein varlığında kazeinin sindirimi metodu ile belirlendi. Bu amaçla kazeinin %1’lik stok çözeltisi hazırlandı. 0.5 mL saf enzim çözeltisi 1 mL kazein üzerine eklenerek reaksiyon başlatıldı. Reaksiyon karışımı 40oC‘de 20 dak. inkübasyona bırakıldı. 20 dak. sonunda reaksiyonu durdurmak için tüp içerisine 3 mL %5’lik TCA ilave edildi ve 1 saat beklemeye bırakıldı. Bir saat sonunda kazein tarafından sindirilmeyen proteinler santrifüj yardımı ile 10000 rpm‘de 5 dak. santrifüjlendi ve süpernatant filitre edildi. Süpernatant içindeki parçalanmış ürünlerin konsantrasyonu Bradford metodu ile belirlendi. Enzim için proteolitik aktivite dakikada parçaladığı mg protein /mL olarak belirlendi (12).

 

Saflaştırılan Proteaz Enziminin Substrat Spesifikliğinin Belirlenmesi

Serum albümin, hemoglobin, azoalbümin, jelatin ve kazein substratlarına karşı, Anadolu orkidesi çiçeklerinden (Orchis anatolica) saflaştırılan proteaz enziminin substrat spesifikliği, enzimin proteolitik aktivitesinden yararlanılarak belirlendi.


Saflaştırılan Proteaz Enzimi Aktivitesi Üzerine Bazı Katyonların Etkisinin İncelenmesi

Anadolu orkidesi çiçeklerinden (Orchis anatolica) saflaştırılan proteaz enzimi aktivitesi üzerine bazı katyonların etkisini belirlemek için konsantrasyonu 0,1 mM, 1 mM, 10 mM olan; CaCl2, MgCl2, HgCl2, ZnCl2, CoCl2, FeCl2 çözeltileri hazırlandı. Son konsantrasyonlar 0,4 mM, 0,8 mM, 1,2 mM, 1,6 mM ve 2 mM olacak şekilde bu çözeltilerden 100 μL, 200 μL, 300 μL, 400 μL, 500 μL alındı.


Saflaştırılan Proteaz Enzimi Aktivitesi Üzerine Bazı Kimyasalların Etkisinin Araştırılması

Anadolu orkidesi çiçeklerinden (Orchis anatolica) saflaştırılan proteaz enzimi aktivitesi üzerine SDS (Sodyum dodesil sülfat), EDTA (Etilen diamin tetra asetik asit) ve β-merkapto etanolün etkileri incelendi. Bunun için saflaştırılan enzimin kazein substratına karşı proteolitik aktivitesinden yararlanıldı.


Sonuçlar ve Tartışma

Proteaz enzimi Anadolu orkidesi (Orchis anatolica) çiçeklerinden %0-20, 20-40, 40-60, 60-80 ve 80-100’lük amonyum sülfat çöktürmeleri yapılarak saflaştırmaya başlanmıştır. Yapılan aktivite ölçümlerinin sonucunda enzimin %40-60’lık amonyum sülfat çöktürmesinde çöktüğü anlaşılmış ve daha sonraki saflaştırma işlemleri için bu çökelek kullanılmıştır. Enzimin bulunduğu çökelek 5 ml 0.1 M’lik pH 6 olan fosfat tamponu içinde çözülmüş ve fazla amonyum sülfatın uzaklaştırılması için aynı tampona karşı diyaliz edilmiştir. Diyaliz edilmiş olan enzim çözeltisi CMselüloz iyon değişim kromatografisi kullanılarak saflaştırılma basamaklarına devam edilmiştir. Şekil 1’de CM-selüloz iyon değişim kolonundan alınan fraksiyonların aktivite absorbans değerleri gösterilmiştir.



Amonyum sülfat çöktürmesi ve CM-selüloz iyon değişim kromatografisi kullanılarak saflaştırılan proteaz enzimi için, her basamakta protein ve aktivite tayini yapılarak saflaştırma kat sayısı hesaplanmıştır. Çizelge 1’de hesaplanan saflaştırma kat sayıları gösterilmiştir.




Ayrıca proteaz enzimi sepharose 4-B L tirozin p-aminobenzoat afinite kromatografisi ile de saflaştırılmış ve daha sonra karakterize edilmiştir. Şekil 2’de afinite kolonundan saflaştırılan enzimin aktivite absorbans grafiği gösterilmiştir. Afinite kullanılarak saflaştırılan proteaz enzimi için saflaştırma katsayısı hesaplanarak Çizelge 1’de verilmiştir.




Anadolu orkidesi (Orchis anatolica) çiçeklerinden saflaştırılan proteaz enziminin optimum pH’sı 6 ve aktif olduğu pH aralığı 4-9 olarak bulunmuştur. Bulunan bu değerler Şekil 3’te gösterilmiştir. Anadolu orkidesi (Orchis anatolica) çiçeklerinden saflaştırılan proteaz enziminin optimum pH’sı 6 ve aktif olduğu pH aralığı 4-9 olarak bulunmuştur.


Anadolu orkidesi (Orchis anatolica) çiçeklerinden saflaştırılan proteaz enziminin aktivite gösterdiği sıcaklık aralığı 10-70oC ve maksimum aktivite gösterdiği sıcaklık ise 60oC olarak belirlenmiş ve Şekil 4’te gösterilmiştir. Anadolu orkidesi (Orchis anatolica) çiçeklerinden saflaştırılan proteaz enziminin kazein substratı kullanılarak, Linewear-Burk grafiğinden yararlanılarak hesaplanan Vmax ve KM değerleri ise sırasıyla 0,16 mg/L.dak ve 2.8x10-3mg/mL’dır.

 

Anadolu orkidesi (Orchis anatolica) çiçeklerinden saflaştırılan proteaz enziminin molekül ağırlığının SDS-poliakrilamid jel elktroforezi ve sephadex G-100 jel filtrasyon kromatografisi kullanılarak 8.4 kDa olduğu bulunmuştur. Anadolu orkidesi (Orchis anatolica) çiçeklerinden saflaştırılan proteaz enziminin substrat spesifikliği araştırılmıştır. Denenen substratlardan hemoglobin, albumin, azoalbunini ve kazeini hidrolizlediği, jelatini ise hidrolizlemediği bulunmuştur (Çizelge 3).

Çizelge 3. Anadolu orkidesi(Orchis anatolica) çiçeklerinden saflaştırılan proteaz enziminin substrat spefikliği sonuçları



Anadolu orkidesi (Orchis anatolica) çiçeklerinden saflaştırılan proteaz enzim aktivitesi üzerine bazı kimyasalların etkisi araştırıldı. β-Merkaptoetanol, SDS ve EDTA ’nın tüm konsantrasyonlar da enzim aktivitesi arttırdığı anlaşılmıştır.

Çizelge 4. Anadolu orkidesi(Orchis anatolica) çiçeklerinden saflaştırılan proteaz enziminin aktivitesi üzerine bazı kimyasalların etkisinin sonuçları



Anadolu orkidesi (Orchis anatolica) çiçeklerinden saflaştırılan proteaz enzim aktivitesini Co2+ tamamen inhibe ettiği, Hg2+ ve Zn2+ kısmen inhibe ettiği görülmüştür. Ca2+ nin aktivite üzerinde çok fazla etkisinin olmadığı Mg2+ enzimi az miktarda aktive ettiği anlaşılmıştır. Fe2+ katyonların etkisi araştırılmıştır ve Fe2+nin enzimi tüm konsantrasyonlar da aktive ettiği gözlenmiştir. Sonuçlar Çizelge 5’te gösterilmiştir.

Çizelge 5. Anadolu orkidesi(Orchis anatolica) çiçeklerinden saflaştırılan proteaz enziminin aktivitesi üzerine bazı katyonların etkisinin sonuçları



Yapılan araştırmalar sonucunda Anadolu orkidesi (Orchis anatolica) çiçeklerinden saflaştırılan proteaz enziminin, proteaz aktivitesinden dolayı sütü çöktürdüğü ve peynir üretiminde kullanılabileceği anlaşılmıştır. Ayrıca Anadolu orkidesi (Orchis anatolica) çiçeklerinden saflaştırılan ve karakterize edilen proteaz enziminin sahip olduğu yüksek enzim aktivitesi ile bu bitkinin özellikle ilaç, kozmetik ve gıda endüstrisinde kullanılabilecek önemli bir hammadde kaynağı olabileceği sonucuna varılmıştır. Hammaddenin bitkisel kaynaklı olmasının tüketici ilgisini ve güvenilirliğini üst düzeyde tutmak açısından çok büyük bir etken olacağı düşünülmektedir.

 

Kaynaklar

• Demir, Y., Alayli, A., Yıldırım, S., Demir, N., 2005. Identification of Protease from Euphorbia Amygdaloides Latex and It’s Using in Cheese Producing. Preparative Biochemistry and Biotecnology 35. 291–299.

 • Fadıloğlu, S. 2001. İmmobilization and Characterization of Ficin. Nahrung/Food 45 (2), 143-146.

• Demir, Y., Güngör, A., Sarıkaya, S.B., Demir, N. 2007 The Purification of Protease from Cowslip (Primula Veris) and Its use in Food Processing. Journal of Food Processing and Preservation. 31, 559-570.

 • Keskin, H., 1987. Besin Kimyası. Güryay Matbaacılık Tic. Ltd. Şti, 49, 51 s, İstanbul.

• Çalkı, Ş., 1999. Bazı Su Ürünlerinde Proteolitik Enzim Aktiviteleri (Katepsin D ve Kazein Test) Tr. J. of Veterinary and Animal Sicences 23, 385390.

• Boller, T., 1986. Roles of Proteolytic Enzymes in Interaction of Plant and Other Organisms. In: Dalling, M.J. (Ed.), Plant Proteolytic Enzymes. CRC Press, Boca Raton, pp. 67–96.

• Rao, A.N. 1977, Tissue Culture in the Orchid Industry. In: Reinert, J. and Y.P.S. Bajaj. (Ed) Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 44-65. Springer Verlag, New York.

• Vavilov, N.I. 1951, The Origin, Variation, Immunity and breeding of Cultivated Plants, Chron. Bot., 13: 1-364.

• Baytop, T., ve Sezik, E. 1968, Türk Salep Çeşitleri Üzerine Araştırmalar. İstanbul Üniv. Eczacılık Fak. Mec. 4: 61–68, 1968.

• Acartürk, Şifalı Bitkiler Flora ve Sağlığımız. 1997, Repo Vizyon Ltd. Şti. Ankara.

• Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of Structural Proteins During the Assembly of the Head of Bacteriophage T4, Nature, 227: 680-685.

• Fadıloğlu, S. (,2001) Immobilization and Characterization of Ficin, Nahrung, 45 (2): 143-146.