Biyofarmasötik İlaçlarda Protein Agregatlarının / Çözünmeyen Partikül Maddelerin Visible ve Subvisib

Biyofarmasötik İlaçlarda Protein Agregatlarının / Çözünmeyen Partikül Maddelerin Visible ve Subvisib

Biyofarmasötik İlaçlarda Protein Agregatlarının / Çözünmeyen Partikül Maddelerin Visible ve Subvisible (SVP) Alanda Ölçülmesi


Proteinin topaklanması (agregasyon), biyofarmasötik ürünlerin klinik deneme periyodunda ve ürünün piyasaya sürülmesinden sonra karşılaşılabilen immünojenik açıdan çok ciddi bir sorundur.

 

Protein topaklanmasının ve çözünmeyen partiküllerin Analitik Metodları ölçüm aralıklarına göre, Şekil 1’de gösterilmektedir. Şekilde görülebileceği üzere, Size Exclusion Chromatgoraphy (SEC) 0.1-0.2 um’nin altındaki oligomerlerinin/ agregatların ölçümü için kullanılmaktadır. SEC metodunun, diğer metodlara göre daha kolay kullanımı ve yüksek tekrarlanabilirliği gibi nedenlerle pek çok avantajı bulunmaktadır.

 

SEC metodu, çalışma prensibi gereği (basınç) protein oligomerlerinin ve topaklanmalarının dağılmasına sebep olabilmektedir. Ancak, FDA ve araştırmacılar, protein oligomerlerinin ve agregatların kantitatif değerlendirilmesi için SEC metoduna ihtiyaç duymaktadır1.


 

Şekil 1. Protein Agregatlarının / Çözünmeyen Partikül Maddelerin Visible ve Subvisible (SVP) Alanda Ölçümü için Kullanılan Analitik Metodların Ölçüm Aralıkları

 

10 um ile 25 um arasındaki çözünmeyen partikül maddelerin değerlendirilmesi için, Light Extinction/ Obscuration analizi (Analitik cihaz: HIAC) dünya genelinde kullanılmaktadır. 2 [Şekil 2].

 

Şekil 2. Light Extinction/Obscuration Metodu Çalışma Prensibi ve Özellikleri

Light Extinction/ Obscuration metodu 10 um - 25 um büyüklüğündeki çözünmez partikülat maddelerin analizi için uzun yıllardır kullanılmakta olsa da biyofarmasötik ilaçlarda protein agregatlarının analizinde karşılaşılan ciddi problemler bulunmaktadır.

 

• Şekil 3’te görüldüğü gibi, dedeksiyon hassasiyeti gölgenin alanı ve yoğunluğuna bağlıdır. Partiküllere ışık uygulandığında, protein agregatlarının [Şekil 3a] ve silikon yağı damlacıklarının [Şekil 3b] dedekte edilmesi zordur, çünkü bu partiküller ışığı geçirmektedir.

 

• Hava kabarcıkları, Şekil 3c’de görüleceği üzere, ışığı bloke ettiği için Light Extinction/ Obscuration metoduna son derece hassastır.

 

• Hangi tür partiküllerin dedekte edildiğini bilmek mümkün değildir.

 

Şekil 3. Çözünmeyen protein partiküllerinin, silicon yağ damlacığının ve hava kabarcığının mikro akış hücresi kullanılarak hücre transmisyon mikroskop altında elde edilen görüntüleri

Aslında, Light Extinction/ Obscuration metodu ile ölçüm esnasında, protein agregatları gerçek partikül boyutlarından daha küçük boyutlarda dedekte edilmektedir [Protein agregatlarının büyüklüğüne bağlı olup genellikle gerçek büyüklüklerinin onda biri kadar dedekte edilmektedir.]. Çözünmeyen partikülat maddelerin doğru analizi için, Light Extinction/ Obscuration metoduna benzer ve hatta daha da geniş bir çalışma aralığı bulunan mikro akış dijital görüntüleme metodu destekleyici/alternatif metod olarak kullanılmaktadır. Mikro akış dijital görüntüleme metodunun prensibi son derece basittir. Yalnızca tüm partiküllerin görüntüsü alınmakta ve partikül büyüklüğü gerçek görüntü üzerinden belirlenmektedir [Şekil 4a ve 4b]. Bu nedenle, Light Extinction/ Obscuration metodunun aksine, mikro akış dijital görüntüleme metodu çoğunlukla silikon yağ damlacığı gibi transparan protein agregatlarının analizinde başarılı sonuç vermektedir. Çözünür olmayan partikülat maddelerin analizinde Extinction/ Obscuration metodunun yerine mikro akış dijital görüntüleme metodunun kullanılması biyofarmasötik ilaç kullanan hastaların büyük protein agregatlarından korunabilmesi açısından son derece önemlidir.


 

Şekil 1’de gösterildiği üzere, 0.1-0.2 um’nin altındaki protein oligomer / aggregate’ları, 10 um ve 25 um’nin üzerindeki çözünür olmayan partikülat maddeler, ve gözle tespit edilebilen partiküllerin analizi ve regülasyonlara göre izlenmesi mümkündür. Öte yandan, yakın zamana kadar, 0.1-0.2 um ve 10 um aralığındaki partiküllerin analizi ve regülasyonlara göre izlenmesi söz konusu değildi. Bu nedenle, bu partiküller "subvisible partikül” (SVP)3 olarak adlandırılmaktadır. Yakın zamanda, bu büyüklüklükteki partiküllerin yüksek immunojenesite özelliği gösterdiği doğrulanmıştır [Şekil 5]. SVP’nin analiz edilememesinin nedeni bu konuda yeterli analitik metodların olmaması idi. Resonant Mass ölçümü kullanan Archimedes, nanopartikül izleme analizi yöntemi ile çalışan NanoSight, ve Laser Diffraction/ Scattering metoduna dayalı Aggregates Sizer, SVP ölçümleri için özel olarak geliştirilmiş olan cihazlardır [Şekil 1].


 

Bu arada, "2nd Progress and Challenges in Protein Particles and Immunogenicity of Biotherapeutics 2015” kongresinde SVP’nin tanımının mevcut 0.2 – 10 um aralığındaki partiküller yerine 1 – 100 um aralığındaki partiküller olarak değiştirilmesi önerilmiştir. [Şekil 1]. Archimedes ve NanoSight gibi SVP analiz cihazları yeni tanımlanan SVP aralığının ölçümünde yetersiz kaldığı için, FDA orthogonal metodların kullanımı önermektedir4. Aynı partiküllerin kantitatif ölçümleri konusunda son derece iyi sonuçlar veren [Şekil 6] Mikro akış Dijital görüntüleme metodu ve Aggregates Sizer, [Şekil 7], yeni tanımlanan aralıktaki SVP’lerin ölçümünü mümkün kılmaktadır.


Şekil 6. Aggregate Sizer ve MFI ile agregat ölçümü sonuçlarının karşılaştırılması

Sonuç olarak, biyofarmasötik ilaçlardaki protein oligomerleri / agregatlar, çözünmeyen partiküller ve SVP’ler tanımlanmış ve halen kullanılan ölçüm metodlarının doğruluğu ile ilgili birçok problem olduğu gözlemlenmiştir.


Başlangıçta belirtildiği üzere, biyofarmasötik ilaçlarda oluşması muhtemel ve hastanın güvenliği açısından bir risk oluşturan agregasyondan kaynaklı immünojenesitelere rastlanabilmektedir. Lazer Difraksiyon / Saçılma tekniği (Aggregates Sizer), geniş ölçüm aralığı sebebiyle (7 nm – 800 um) visible ve SVP ölçümleri için güvenle kullanılabilecek bir tekniktir.

 

Kaynaklar:

1. Shire SJ. Assessment of Self-Association of Protein Therapeutics at High Concentration and its Impact on Viscosity. International Light Scattering Colloquium 2006.

2. Thomas D. Particle Cheracterization Using Flow Microscopy. 2008 BioProcess Intarnational Conference & Exhibition: Formulation Strategies for Protein Therapeutics 3. Carpenter JF. et al. 2008. Overlooking Subvisible Particles in Therapeutic Protein Products: Gaps That May Compromise Product Quality. J Pharm Sci, ODI: 10.1002/jps.21530.

4. Susan L. Kirshner. Regulatory Expectations for Analysis of Aggregates and Particles. 2014 Workshop on Protein Aggregation and Immunogenicity, 2014.July 17th.